high quality precision analysis
>주요서비스>DNA Sequencing>Basic sequencing>Troubleshooting
| Code | Description |
|---|---|
| 분석종료 | 모든 data가 guarantee range까지 고르게 읽혀 분석이 종료된 상태 공통적으로 결과가 좋지 않거나 sample의 특이구조에 의한 분석저해일 경우에도 분석종료로 판정 |
| 재반응진행 | 결과가 좋지 않은 경우, 아래 trouble shooting에 따라 개선의 여지가 있는 reaction에 대해 자동으로 재반응이 진행되는 상태(무료) 단, DNA quality나 구조에 의해 반응결과가 좋지 않은 경우 진행하지 않음. 또한, 본래 진행 내역에 변경이 있는 경우 유료로 진행 |
| Re-running | 기기 running상 고르지 않은 peak이 나왔을 경우나 intensity가 너무 높은 경우에, 기기 running만 다시 진행하는 상태(무료) |
| 추가 sample & primer 요청 | 결과가 좋지 않은 경우, sample이나 primer의 부족으로 자동으로 재반응이 진행되지 못한 상태. 주문번호와 함께 sample또는 primer를 보내주시는 경우 바로 재반응 진행(무료) |
Peak이 매우 불규칙적으로 보이며 원하는 DNA의 sequence와 상관이 없는 sequence가 보인다.
| 원인 | Quality가 매우 낮은 sample로 반응 진행 시 DNA와 matching이 되지 않는 primer 사용 시 |
|---|---|
| 해결방안 | DNA 의 Quality를 높인다. (purification을 진행하거나, DNA의 농도가 낮은 경우 DNA의 농도를 높여준다.) DNA에서 primer가 Binding이 되는지 확인한다. |
불규칙적인 작은 Peak이 base line에 보이며, main peak을 확실히 구분하기 어렵도록 noisy 하게 보인다.
| 원인 | DNA의 농도가 기준하는 수치에비해 너무 낮거나, 과량의 DNA로 반응이 진행된 경우 Primer의 반응성이 저해된 경우 이거나(degradation이 되었거나 Tm 값이 맞지 않는 경우) primer의 농도가 너무 낮을 경우 |
|---|---|
| 해결방안 | 적정 농도의 DNA와 primer를 사용하여 반응을 진행 Stock primer를 다시 dilution하여 진행하거나, Tm 값이 50~58℃정도가 되도록 design하여 반응 진행 |
70bp~90bp 사이와 120bp 근처에 2~3개의 peak이 비정상적으로 크게 보이는 현상이다.(주로 C peak이 먼저 나타남)
| 원인 | DNA의 농도가 너무 낮을 경우 (signal strength가 낮아서 보일 수 있다.) Sequencing PCR 진행 이후 정제 과정에서 소량 남아있는 Big Dye로 인해 큰 dye blob peaks으로 보이는 경우. |
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| 해결방안 | DNA의 농도를 측정하여 반응 진행 시 적정량의 DNA를 사용한다. |
두 개 이상의 서로 다른 Peak이 겹쳐 보이는 현상
| 원인 |
Plasmid 의 경우(첫 번째 이미지 참고) Insert가 시작 되는 부근에서 mixed bace가 시작되는 경우가 대부분으로, insert contamination 일 경우 나타난다. PCR product의 경우(두세 번째 이미지 참고) 두 가지 이상의 다른 DNA가 섞여 있거나 한 가지 DNA에 여러 개의 primer binding site가 존재할 경우 나타난다. |
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| 해결방안 | DNA의 농도를 측정하여 반응 진행 시 적정량의 DNA를 사용한다. |
Guarantee 범위 이전에 signal이 끊어져 읽히지 않은 경우(짧은 DNA제외)
| 원인 |
샘플의 농도가 기준치보다 낮을 경우(권장농도: 150~200ng/ul) / 첫번째 사진 참고 Poly sequence, repeat seq, G-C rich, Short hair pin 구조…등 DNA 특성상 나타나는 분석 저해 / 2~4 번째 사진 참고 |
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| 해결방안 |
시료의 각 ul당 농도를 높여 진행하거나, 반응 진행시 더 많은 양의 DNA로 sequencing용 PCR진행 G-C rich, Short hair pin 구조가 포함된 DNA의 경우 difficult sequencing을 진행하여 현상을 완화시킬 수 있으나, 100%의 성공률은 아니다. Poly sequence, repeat sequence의 경우 반대쪽으로 읽을 수 있는 primer를 사용하여 확인할 수 있으나, 동일 구간에서 같응 양상이 나타날 수 있다. |
1)pull up peak
Data초반의 signal이 강하게 나타나서 peak과 peak사이에 비특이적인 작은peak이 보여 main signal을 방해하는 양상
| 원인 | 과량의 DNA가 들어갔을 경우 주로 Size가 작은 pcr product에서 나타남 |
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| 해결방안 | Running전의 최종 시료를 dilution하여 다시 running하면 깨끗한 결과를 얻을 수 있다. |
2) Broad peak
Data 중간에 일부 혹은 특정부분 이후에 peak이 퍼져보이는 현상
| 원인 | 기기running시 polymer에 의해 나타나는 양상 |
|---|---|
| 해결방안 | Running을 다시 한 번 하면 깨끗한 결과를 얻을 수 있다. |
3) Spike peak
Data 중간 한 부분에, 모든 종류의 peak이 한꺼번에 비정상 적으로 튀는 현상
| 원인 | 기기 running시 capillary 끼어든 air bobble에 의해 나타나는 양상 |
|---|---|
| 해결방안 | Running을 다시 한 번 하면 깨끗한 결과를 얻을 수 있다. |
